En este experimento se irradia una señal durante un cierto tiempo (2-5 T1) con una potencia no muy elevada, pero suficiente para saturar la señal. Si el protón que origina la señal perturbada se relaja dipolarmente con otros protones de la molécula (próximos en el espacio), las señales de estos protones experimentarán cambios de intensidad. En primera aproximación estos cambios se pueden considerar dependientes de la distancia entre los protones. En los equipos de la serie Unity es posible determinar la presencia de Noe mediante varios experimentos, a continuación se describen dos de los experimentos que se pueden utilizar.

Los experimentos de Noe resultan muy sensibles a las condiciones experimentales, tanto por lo que respecta a la preparación de las muestras como a la realización del propio experimento. Un error en las condiciones puede suponer la disminución de la intensidad de los Noe´s o su no-observación. En la literatura existen numerosas referencias que tratan con gran extensión este tema, entre las que cabe destacar el libro de THE NUCLEAR OVERHAUSER EFFECT de D. Neuhaus y M. Williamson (VCH).

• La muestra debe estar correctamente disuelta, sin partículas en suspensión.
• La concentración no debe ser muy elevada para evitar que los posibles Noe's intermoleculares interfieran con los intramoleculares.
• La muestra debe estar exenta de impurezas paramagnéticas y desgasada convenientemente.

2.2.- Condiciones experimentales.

• Realización de los experimentos a temperatura controlada.
• Debe procurarse que las condiciones experimentales sean similares para todos los espectros, tanto en el de control, como en el resto.
• Se deben evitar en lo posible las perturbaciones externas, pe. movimientos cerca del imán, variaciones de temperatura, etc.
• Es conveniente que el experimento se realice con el tubo parado.
• La utilización de un pequeño lb puede mejorar la resta de Fid's/espectros (pe. lb=1 ó 2).
• La señal de deuterio debe estar fija durante todo el experimento. Utilizando el mínimo lgain posible y compensando con el lpower (pero evitando la saturación de la señal de lock).

Se realizan dos espectros, por lo general en el mismo experimento, en el primero se irradia la señal del protón que se quiere comprobar si tiene o no Noe con otros protones de la molécula, mientras que el segundo se realiza en las mismas condiciones pero irradiando en una posición donde no haya ninguna señal y se utiliza como control para comprobar la existencia de variaciones de intensidad. Los dos espectros se comparan entre sí, utilizando las integraciones o las intensidades de las señales. El resultado también se puede presentar como resta de espectros.

1. En el experimento 1 realizar un espectro de protón, para poder seleccionar las posiciones de irradiación. Mover el Fid a otro experimento mf(1,2) donde quedará almacenado.
2. Transformar el Fid wft, ampliar la zona de la señal o señales a irradiar.
3. Con un cursor seleccionar las señales a irradiar, situando el cursor sobre la señal y introduciendo la orden sd, anotar en cada caso el valor del dof que aparece en la pantalla. Por razones de orden práctico no se recomienda seleccionar más de 4-5 señales cada vez (a no ser que se prevea realizar el experimento por la noche).
4. Seleccionar una zona libre de señales e introducir sd, esta irradiación se utilizará como control.
5. Introducir en el dof los valores de frecuencia encontrados en los puntos 3 y 4 dof=$$, $$, $$,control (se crea un array de experimentos). Si se utiliza un array debe ponerse gain=´y´, ya que en este caso el equipo no puede calcular la ganancia automáticamente. Comprobar con da que se ha creado el array de manera correcta
6. Modificar las condiciones para que se puedan realizar las irradiaciones: dn=´H1´ homo=´y´ dmm=´c´ dm=´ynn´ (irradiación durante D1) dpwr (entre 4 y 14) el valor de dpwr debe ser suficiente como para saturar la señal y no afectar apreciablemente a las vecinas. La potencia del desacoplador debe ser tal que la señal irradiada se sature en aproximadamente un 50%. El tiempo de irradiación d1 debe ser 5*T₁ (Si no se conoce el T₁ utilizar valores entre 7 y 14 segundos). Ajustar el pulso al valor de 90º.
7. El número de acumulaciones debe ser suficiente como para poder obtener un espectro con una buena relación señal-ruido (NT entre 64 y 256), aproximadamente entre 10 y 100 veces el número necesario para obtener el espectro inicial (utilizar múltiplos de 32).
8. il=´y´ para que todos los espectros del array se realicen en las mismas condiciones. bs=8.
9. Fijar el valor del ss (pe, 4).
10. El experimento se debe realizar en intensidad absoluta ai y no con la intensidad normalizada. En el proceso de tratamiento de datos, según sea el procedimiento elegido para restar los espectros, puede ser necesario representar los espectros con la intensidad normalizada nm.
11. Parar el giro del tubo y comprobar que el parámetro spin es igual a cero o no se utiliza. Reajustar el nivel de lock teniendo en cuenta que el ruido de la señal sea el menor posible.
12. Seleccionar una temperatura, ligeramente superior a la ambiente. Activar las condiciones con su y esperar que la temperatura se estabilice
13. Poner el experimento en marcha con go o ga.

1. Registrando los espectros (ai) correspondientes a cada una de las irradiaciones, la comparación de los valores de las integraciones o de las intensidades de las señales, con las que se obtienen en el espectro patrón, permitirá determinar la existencia de Noe y cuantificarlo Figura -1. Evidentemente el registro de todos los espectros se debe realizar en las mismas condiciones.

 


2. Otra posibilidad consiste en restar del espectro con Noe el espectro patrón, con lo que se obtiene un espectro en el que la señal irradiada aparece como negativa, si algún protón tiene un NOE positivo aparece una señal positiva de poca intensidad para este protón (Figura-2). En el caso de que existan señales negativas, estas pueden atribuirse a: Noe´s negativos, Noe´s indirectos o bien a transferencia de saturación. En este tipo de representación se deben localizar y descartar las señales que presentan una fase con aspecto de dispersión ya que son errores de resta .

• clradd (inicializa el experimento 5 borrando los datos que contiene)
• Seleccionar un valor de lb ( entre 0.5 y 1.5), lb=.5 wft
• ds(1) , seleccionar el espectro 1 del array y ajustar la fase
• spadd guarda el espectro en el buffer temporal de suma y resta.
• ds(2) ajustar la fase
• spadd guarda el segundo espectro en el buffer temporal.
• addi activa el menú de resta y suma de espectros.
• En el menú activar la opción sub para tener la resta de espectros.
• Mediante la opción select es posible seleccionar cada uno de los espectros que muestra la pantalla, seleccionar el correspondiente a la resta.
• Ajustar las condiciones del display y activar la opción save. Con esta operación el resultado queda guardado en el experimento 5, donde puede ser guardado en el disco, o bien registrarse del mismo modo que un espectro realmente adquirido.

Esta secuencia permite obtener espectros de Noe en los que la resta entre el espectro irradiando una señal determinada y el que se utiliza como patrón, se efectúa directamente. En realidad se restan los Fids mediante un cambio de fase en la detección y el espectro adquirido ya corresponde a la resta. Esta secuencia utiliza para la observación pulsos compuestos de 90º , ya sean de 3 ó 10 pulsos, ello permite la irradiación de una única línea de un multiplete.

Uno de los mayores problemas en los experimentos de Noe es poder irradiar de una manera uniforme y completa todas y cada una de las líneas que componen un multiplete, la utilización de potencias relativamente elevadas puede perturbar las señales contiguas o a sus satélites de C13, originando confusiones en la interpretación de los resultados. Por otra parte la utilización de potencias bajas, para tener una buena selectividad, puede dar lugar a una saturación parcial no uniforme de las señales del multiplete con la consiguiente transferencia selectiva de población SPT. La SPT se manifiesta por la aparición de sistemas en antifase de los protones acoplados con el protón irradiado que puede ocultar los incrementos de intensidad debidos al Noe. La eliminación o disminución de los efectos de SPT se puede conseguir mediante la irradiación de todas y cada una de las líneas del multiplete o bien por la utilización pulsos de 90º (correctos) para la observación. La utilización de un simple pulso de 90º no es efectiva debido a las imperfecciones de rf, los mejores resultados se obtienen con la utilización de pulsos de 90º compuestos, en este caso se pueden obtener resultados correctos aunque sólo se irradie una de las líneas del multiplete. La secuencia Noe1d utiliza este "truco" con lo que es posible utilizar potencias muy bajas, mayor selectividad, e incluso es posible utilizarla en el caso de multipletes parcialmente solapados.

Los inconvenientes que presenta consisten en: necesidad de tener una buena forma de línea en las señales y una mayor sensibilidad del experimento a los posibles cambios de los circuitos de rf. El resultado también puede verse afectado de modo negativo por el ruido generado por la amplificación de la señal de lock (lockgain).

1. Realizar un espectro de protón standard a temperatura controlada. Seleccionar las posiciones de irradiación del listado de señale, utilizando el listado de señales (dll) o mediante la opción Mark del menú.
2. Mover el Fid a otro experimento, mf(#,%).
3. Parar el giro de la muestra.
4. Ajustar las condiciones de lock, de modo que la señal de lock tenga el mínimo ruido posible, bajando el lock gain y compensando con el lock power, pero sin que se produzca saturación. El nivel de lock debe ser suficientemente elevado como para que no se pierda durante la realización del experimento.
5. Llamar la secuencia y condiciones mediante el macro noe1d .
6. Introducir la frecuencia de la señal a irradiar satfrq=$$$$ (no utilizar el comando sd!). Introducir la frecuencia de control offres=&&&& que debe corresponder a una zona sin señales. Idealmente el offres debe ser simétrica con respecto el satfrq alrededor de la señal que da Noe.
7. Ajustar las condiciones del desacoplador.:dm=´nyn´ diff=´y´ para el espectro de Noe diferencia con la resta directa. longcomp=´y´ para tener un pulso de 90 compuesto (10 elementos) en caso contrario se utiliza un pulso de tres elementos,
8. Ajustar el número de acumulaciones, que debe ser múltiplo de 16. Se debe tener en cuenta la aparente perdida de sensibilidad del experimento. El número de acumulaciones dependerá de la intensidad de las señales a observar y puede ser entre 3 y 6 veces superior a las utilizadas para obtener un espectro normal con buena relación señal ruido.
9. Seleccionar la potencia de irradiación dpwr, esta debe ser suficiente como para poder saturar completamente la línea elegida, no es necesario saturar todo el multiplete. Si la línea está bien definida se puede empezar por una potencia de 2 a 4. En el caso de que sea necesaria una gran selectividad, solapamiento de señales, es posible utilizar potencias inferiores.
10. Comprobar que el pw corresponda a un pulso de 90ºy ajustar el valor de gain y d2 (de 1-3 T1).
11. Poner en marcha el experimento con ga o go.

El experimento proporcionará un espectro resta, en el que la señal irradiada será negativa y las señales con Noe pueden ser positivas o negativas según sea el signo del Noe. La cuantificación del Noe es difícil ya que en la mayoría de los casos la saturación de la señal sólo es parcial, por lo que puede ser necesario efectuar correciones del valor obtenido. En la Figura 3 se muestra un ejemplo de la aplicación de esta técnica. En la Figura 4 se puede ver la variación de la selectividad en función de la potencia del desacoplador, la disminución de la potencia no ocasiona una considerable modificación de los resultados.

La mayoría de los puntos descritos para la anterior versión son válidos para esta; sólo se modifican sustancialmente los puntos 6, 7 y 8 .

• Es posible construir un array de espectros correspondientes a diferentes valores de irradiación, entrando las correspondientes frecuencias en el parámetro satfrq.
• Se selecciona el valor de la frecuencia, o frecuencias de control. Es posible crear un doble array diagonalizado de modo que cada saturación de línea tenga su valor de control óptimo.
• dm=´nyn´ diff=´n´ logcomp=´y´

• En el caso de que no haya problemas de selectividad se ha comprobado que los resultados obtenidos tanto por el método denominado "clásico" como por el "Noe1d"son comparables. En cambio cuando se debe tener una selectividad elevada, los multipletes no están bien definidos o son muy anchos la utilización del Noe1d resulta ventajosa.
• De las dos posibilidades que ofrece la secuencia del Noe1d la correspondiente a las irradiaciones múltiples es más conveniente para obtener cuantificaciones del Noe, pero en los casos en los que existen dificultades en la resta o bien en los que el valor del Noe es muy pequeño, puede ser más conveniente la utilización de la opción de resta directa.
• En la realización de los experimentos de Noe se debe evitar, siempre que sea posible, la utilización de disolventes con protones intercambiables. En cuanto a los disolventes deuterados los mejores son aquellos que dan lugar a una señal de lock aguda como la acetona-d6, dmso-d6, en cambio el cdcl3 y el D2O no son los más adecuados debido a que su señal, H2, es ancha lo que posibilita unas mayores variaciones del campo. En ocasiones puede ser necesario añadir cosolventes como el etilenglicol para pasar el punto de Noe cero. 1.12. Debe evitarse la presencia de grandes concentraciones de otros solutos, pe. TMS, que interaccionen con el producto a estudiar, ya que pueden contribuir a la relajación dipolo dipolo.
• La potencia de irradiación debe ser suficiente pero no excesiva, teniéndose en cuenta que la irradiación continuada a potencias relativamente elevadas puede ocasionar cambios de temperatura en la muestra, en especial en soluciones acuosas y con sales. Ello puede provocar cambios de desplazamientos químicos de algunas señales.
• La adquisición de bastantes acumulaciones permitirá eliminar las imperfecciones aleatorias de la resta de espectros. La concatenación de bloques disminuye las imperfecciones debidas a variaciones a largo plazo, pe. oscilaciones de temperatura. Es conveniente que entre bloque y bloque se realicen una serie de dummy scans.
• El tiempo de irradiación depende del tiempo de relajación T1 de los protones implicados y para que los resultados sean plenamente cuantitativos debe ser como mínimo unas 5 veces el T1. En cambio si sólo se desea un resultado semicuantitativo, del orden de fuerte, mediano o débil, el tiempo de irradiación puede ser sensiblemente menor, de 5 a 10 segundos para moléculas con peso molecular entre 100 y 500.
• Es conveniente introducir un pequeño espacio de tiempo de descanso, de 1 a 5 ms, entre la irradiación y el pulso, con ello se mejora la resta de espectros.
• En el caso de que se precisen resultados cuantitativos con una cierta exactitud es recomendable repetir los experimentos con distintos tiempos de irradiación y potencias de saturación y comprobar la reproducibilidad de los valores,
• En los experimentos de Noe se recomienda utilizar pulsos de 90º, compuestos o no, para tener el máximo de sensibilidad.
• Si los Noe´s a observar son de baja intensidad, es de especial importancia extremar las precauciones en la purificación, preparación de la muestra, elección del disolvente y en el desgasado de la solución mediante ciclos de frío-vacío.